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Mercoledì, 27 Agosto 2014 10:20

Research in Progress

Development of virus like particles for the immunization of cattle against epizootic haemorrhagic disease virus

Granted by : Italian Ministry of University (type of grant:  rientro dei cervelli), 2009


Fortalecimiento de la red de salud en el Chaco Boliviano: una perspectiva comunitaria

Granted by  The Italian Ministry of Foreign Affairs, 2009


Development of virus like particles for the epizootic haemorrhagic disease virus as a model for the generation of  safe vaccines to control animal and human transmissible diseases.

Granted by Regione Toscana,  type of grant: regional research  in public health 2009


Development of real-time and RT real-time PCR assays to evaluate the viral load in goats immunized with a small ruminant lentivirus  strain

Granted by : Italian Ministry of University, 2010


Monitoring of avian influenza with a prototype of mobile laboratory.  In collaboration with the Istituto Zooprofilattico delle Venezie, Padova 

Fondazione Monte dei Paschi di Siena, grants  2007 and 2008


Eradication of BVD virus infection in cattle:  experiences carried out in some herds in Tuscany 

Granted with funds of the University of Pisa


Development of real time PCR protocols for the detection of viruses of honey bees.

Granted with funds of the University of Pisa


Eradication of BoHV-1 infection in cattle: monitoring of the regional eradication protocol in some herds in Tuscany

Granted with funds of the University of Pisa


Development of a recombinant antigen from an Italian swine isolate of hepatitis E virus to be used for the diagnosis of infections in humans and animals.

Granted with funds of the University of Pisa



 

 


Abstract 1

Orbivirus genus in the family Reoviridae, is related to bluetongue virus (BTV). The EHDV can infect deer and the disease occurs in North America, Australia, Asia and Africa. Similarly to the other members of the Orbivirus genus EHDV is transmitted by midges of the genus Culicoides. EHDV and BTV share almost identical clinical signs in cattle. Although EHDV is reported to affect cattle only sporadically, several outbreaks have been recentlyreported in cattle in four Mediterranean countries, namely Morocco, Algeria, Tunisia, Israel and Turkey. Since 1998, outbreaks of BTV sustained by 6 different serotypes have occurred in Europe, involving 15 countries. The disease has caused the loss of thousand of animals with an important economical damage. On the wave of the recent outbreaks of BTV in Europe, few questions have emerged about the possibility that EHDV could also reach soon our continent. Referring to this aspect it is extremely interesting to note how the latest EHDV outbreaks in Mediterranean basin are tracing the spreading of BTV into south Europe. Furthermore, it has been speculated that the global warming can be responsible for the northwards spread of Orbivirus diseases. On the light of these considerations it is therefore important to generate adequate immunogens to control future outbreaks of EHDV in European cattle. To date, there is no vaccine available for EHDV. The aim of this study is to develop an effective and safe vaccine for EHDV by the generation of virus like particles (VLPs). VLPs are nowadays considered as a safe and effective option to live attenuated or chemically inactivated vaccines. By generating VLPs it is possible to trigger the same immunological responses as with the whole virus, with the advantage to deal with an immunogen free of viral genetic material. By cloning the capsid proteins of EHDV from viruses isolated during the latest Mediterranean outbreak, it will be possible to generate recombinant proteins with the baculovirus expression system. The co-expression of these proteins will result in the production of self-assembled VLPs able to mimic EHDV virions. The generation of EHDV VLPs will represent a new tool to control possible outbreaks of the disease in European cattle by means of immunisation. The VLPs preparations will provide also new purified antigens to be used for serological surveillance.

Abstract 2

El proyecto con la cofinanciación del Ministerio de los Asuntos Exteriores de Italia y se propone de fortalecer los servicios socios sanitarios en las provincias bolivianas de Cordillera, Gran Chaco, O'Connor, Hernando Siles y Luis Calvo, con un particular acento a los servicios diagnósticos y de salud ambiental, en un enfoque de gestión participada. Trabajamos con las comunidades vulnerables, favoreciendo procesos  inclusivos de desarrollo sostenible. El objetivo del proyecto es Mejoramiento del  nivel de vida en la población en la Región del Chaco, desde una perspectiva de la epidemiología comunitaria realizada con la participación de todos los actores de las comunidades". Objiectivos especificos son:

--dar continuidad a las acciones de coordinación y mejoramiento de la calidad de los servicios clínicos básicos de la red de salud del Chaco;

--profundizar y mejorar los conocimientos epidemiológicos acerca de algunas zoonosis; capacitar a los alumnos de la escuela de salud humana TEKOVE KATU (Municipio de Gutiérrez),

--en el reconocimiento de las síntomas, prevención y terapia de las enfermedades zoonóticas mas prevalentes en el Chaco Boliviano;

--monitorear la identificación de cepas bacterianas resistentes a  diferentes antibióticos de uso humano, en muestras de origen animal.


En el ambito del proyecto el grupo VIROVET se encargará de apoyar el personal técnico del  Laboratorio de Investigación y Diagnostico veterinario (LIDIVET) en el diagnostico de rabia y enfermedad del virus del Nilo occidental. Para la rabia, se aislarà el virus utilizando las culturas celulares de neuroblastomas de ratón conjuntamente con la imunofluorecencia directa. El método de PCR será utilizado con fines diagnósticos y para identificar aislados virales. El método de PCR real time será utilizado para detectar infecciones en los murciélagos y en muestras de saliva en animales domésticos o silvestres con sospecha de enfermedad. Donde el ambiente lo requiera, se realizarà captura de murciélagos, especialmente en las áreas más afectadas. Para monitorear la circulación del virus de Nilo occidental, que no ha sido todavía aislado en Bolivia y del que se teme en una posible aparición (existen condiciones idóneas al virus que podría llegar con aves migratorios), LIDIVET utilizarà las muestras de suero de pollos que le llegan del programa nacional PRONESA sobre enfermedades de los aves. La prueba utilizada será el ELISA.

En el área de docencia seràn impartidos algunos tópicos de enfermedades infecciosas viricas a los estudiantes de  la escuela de salud humana TEKOVE KATU a través de exposición de temas por parte del docente y realización de trabajos prácticos.



LIDIVET1a Camiri1a Gitierrez1a
Gitierrez3a Gitierrez2a LaPaz1a

 


Abstract 3

The main aim of this project is the development of an effective vaccine against EHDV based on viral like particles. In order to be a realistic vaccine candidate, VLPs needs to be produced in an expression system that is safe and open to large-scale production. For these reasons, most of the VLPs used nowadays as vaccines have been generated using the baculovirus expression system. VLPs have been generated and patented for several viruses (e.g. Nodavirus and Human Papilloma virus ) as a possible approach to generate safe and innovative vaccine for animal and human immunisation. The intent of this project is to generate recombinant baculoviruses able to express the inner and outer capsid proteins of EHDV (VP2, VP5, VP3 and VP7). Among them VP2 is the protein responsible for the serotype specificity and for eliciting immunological response. Co-expression in insect cells of between two and four of these capsid proteins will enable the production of VLPs that are empty of the viral genome but otherwise indistinguishable from authentic viral particles. The VLPs will be generated using serotypes of EHDV recently isolated in the Mediterranean countries, to have a more reliable vaccine in the prospective of a possible European outbreak.

The final aims of the research are the production of EHDV VLPs that could be used for immunisation purposes.

The success of the above aims will give the chance to:

- generate a vaccine to control the spread of EHDV infection in cattle population by means of immunisation;

- develop highly purified reagents to be used in serological surveillance  (the VP2 protein in particular can be used to generate commercial serological kits);

- develop a model for the production of safe vaccines to control animal and human infectious diseases.


Abstract 4

Our group is one of the four teams involved in the national research project "Genetic, antigenic and biological characterization of atipical small ruminant lentiviruses in Italy, implications in diagnosis and control".  Our research unit will select in Tuscany ovine, caprine and mixed flocks, preferentially of local breeds. Our group will extract DNA from buffy coats of all animals belonging to the infected flocks and carry out gag PCR assays to confirm serological results and to identify infected animals, if any, among the serologically negative ones. Phylogenetic analysis will be carried out on the gag amplified fragments. We are developing  highly sensitive real-time and RT real-time Taqman PCR assays to determine viral load and transcriptional activity of both the vaccine strain low pathogenic caprine lentivirus (LPCLV) and the challenge CAEV-Co strains, in blood, milk and tissues of goats immunized by another unit. Two structural genes, gag and pol, will be assessed as targets for amplification. Additionally, the regulatory revthis isolate shares homology with a newly identified phylogenetic group (genotype E), which includes strains originated from Sardinia. gene will be used as a target for expression analysis, to acquire information on viral replication. Our unit will analyze LPCLV and CAEV-Co viral load kinetics in blood; LPCLV and CAEV-Co viral load in milk of goats mated after challenge and LPCLV and CAEV-Co viral load in tissues. We  will also characterize by whole genome of a local atypical CAEV-like SRLV strain. Preliminary analyses have shown that this isolate shares homology with a newly identified phylogenetic group (genotype E), which includes strains originated from Sardinia.


Abstract 5


Per molti paesi in via di sviluppo (PVS) la presenza di malattie infettive nel bestiame è un freno al loro sviluppo economico ed un fattore che mette in pericolo la sopravvivenza delle comunità rurali. Le conseguenze delle malattie, siano esse dirette (mortalità, diminuzione delle produzioni, spese per farmaci e vaccini) che indirette (limitazioni commerciali, abbattimenti forzati per fermare la diffusione dell'infezione) implicano perdite gravi, che non investono soltanto la sfera alimentare. Gli animali significano anche lavoro, mezzi di locomozione, concimi per l'agricoltura, combustibile per scaldarsi, materie prime (pelli, lane) da lavorare e riserva per la sopravvivenza nei momenti economicamente difficili.
Ne consegue che la lotta contro le malattie infettive degli animali nei PVS è anche un modo efficace di combattere la povertà. L'accesso a strumenti diagnostici efficienti è un  requisito importante, ma spesso strutture troppo complesse sono eccessivamente costose per i PVS.
I laboratori biologici mobili potrebbero venire incontro all'esigenza di fornire strutture diagnostiche  efficienti, a rapida utilizzazione e a costi contenuti ai paesi che si trovano in situazioni disagiate,  consentendo di combattere malattie infettive a notevole impatto economico e sociale là dove si manifestano.
Le finalità del progetto sono quelle di sperimentare l'utilizzo di un prototipo di laboratorio mobile da campo di classe 3, dotato di attrezzature per la diagnostica virologica, prevalentemente di tipo biomolecolare ed immunoenzimatico, in una ricerca di campo sulla influenza aviaria.
La rispondenza del laboratorio alle esigenze della diagnostica per questa malattia assicurerà che, con minime variazioni di apparecchiature e layout, lo stesso laboratorio potrà essere utilizzato anche per la diagnostica di altre malattie infettive.
Il prototipo di laboratorio mobile in sperimentazione è racchiuso in  un container (shelter) espandibile a tre volumi. Altri due container contengono le attrezzature di supporto tecnico-logistico. Lo shelter a tre volumi è dotato di sistema di espansione meccanico che permette di passare dalla configurazione compatta a volume unico, adatta al  trasporto, alla configurazione espansa con aumento in volume dell'area operativa ed è dotato di dispositivo di autosollevamento per carico e scarico dal pianale di un camion. Lo shelter è dotato di attrezzature per la diagnostica virologica di tipo biomolecolare ed immunoenzimatica. Altri aspetti tecnici rilevanti sono: sterilizzazione dell'aria in entrata ed uscita tramite filtrazione, climatizzazione, autonomia energetica ed idrica e raccolta degli scarichi.
L'Università di Pisa, tramite i Proff. Tolari ed Arispici, è l'Istituzione proponente il progetto; la ditta Mobile Modular Hospitals (MMH) di Sovicille (Siena) sta costruendo il laboratorio; il partner cofinanziatore ed utilizzatore del prototipo è il Laboratorio di Referenza Nazionale per l'influenza aviaria dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro (Padova).

Mobile lab.pdf


Abstract 6


Le infezioni da BVDV arrecano danni notevoli agli allevamenti bovini da riproduzione.
Attualmente in diversi paesi europei la BVD è sottoposta a piani di controllo su base volontaria e molti paesi del nord Europa hanno già eradicato l'infezione. Nel nostro Paese il primo piano di controllo ed eradicazione strutturato è stato adottato nel 1999 nella provincia autonoma di Bolzano ed è divenuto obbligatorio con un decreto del 10.03.2009.  Esperienze più limitate sono in corso in poche altre province. Durante la nostra ricerca saranno individuati alcuni allevamenti bovini da riproduzione interessati ad acquisire l'indennità da BVDV. In questi allevamenti sarà adottata una strategia di controllo di tipo "sistematico" secondo i criteri del network europeo sul controllo della BVD. Le tre misure sanitarie chiave di questa strategia sono:

  • -identificazione ed invio al macello dei soggetti persistentemente infetti (PI);
  • -applicazione di misure di biosicurezza per prevenire l'introduzione o reintroduzione dell'infezione negli allevamenti indenni (evitando contatti con soggetti potenzialmente PI, introduzione di PI o femmine gravide portatrici di feti infetti)
  • -sorveglianza per monitorare i progressi fatti identificando rapidamente eventuali reinfezioni.


Per far acquisire ad un allevamento lo stato di BVD free, è necessario sottoporre a test virologici tutti i soggetti dell'allevamento per identificare ed eliminare i soggetti PI e successivamente testare tutti i vitelli che nasceranno nel corso dell'anno successivo. Come test virologico utilizzeremo un test di RT-PCR real time a metodologia TaqMan che amplifica la regione 5' UTR, quella maggiormente conservata nel genoma virale di BVDV. Questo test è stato sviluppato nel corso di una precedente
ricerca. Soltanto in  casi particolari si prevede di ricorrere all'esame colturale seguito da immunocitochimica.  Negli allevamenti che non praticano vaccinazione sarà eseguito l'esame sierologico su tutti i soggetti dell'allevamento e successivamente il test virologico soltanto sui soggetti risultati sieronegativi o con titoli anticorpali molto bassi.  Come test sierologico utilizzeremo un test di ELISA competitivo.
Nei monitoraggi successivi, per accertare se il virus continua a circolare nell'allevamento saranno eseguiti monitoraggi sierologici su alcuni soggetti sentinella,  di età superiore ai 6 mesi (e pertanto liberi di anticorpi di origine materna) e  non vaccinati. Negli allevamenti da latte si ricorrerà anche  a test sierologici e virologici sul latte di stalla.


Abstract 7


Virovet ha recentemente iniziato a collaborare con il gruppo di ricerca del Dott. Felicioli (Dipartimento di Scienze Fisiologiche) nello studio di alcune delle virosi delle api più diffuse.
Il programma della ricerca è lo sviluppo di protocolli di real-time PCR per la diagnosi virologica in api e in diverse tipologie di prodotti dell'alveare.
Attualmente è in corso una tesi sperimentale nel corso di laurea magistrale in Medicina Veterinaria sulla messa a punto di un protocollo di real time TaqMan per la evidenziazione del deformed wing virus responsabile di una malattia delle api diffusa in tutto il mondo e che si manifesta in presenza di infestazione da varroa.


 

Abstract 8


Negli ultimi anni si è assistito ad una  presa di coscienza da parte delle autorità sanitarie e degli allevatori delle gravi conseguenze economiche che le infezioni da BoHV-1 arrecano alla zootecnia e si sono intensificate le iniziative per eradicare l'infezione. L'Unione Europea, rinunciando ad imporre un piano di eradicazione comunitario, ha lasciato ampia autonomia ai singoli stati membri sulla strategia più idonea da adottare.
I Paesi scandinavi e diversi altri del nord Europa sono stati i primi ad avere eradicato l'infezione. In diversi altri paesi europei si stanno attuando piani di eradicazione che integrano la strategia del test and slaughter con la vaccinazione con vaccini gE deleti. Per quanto riguarda l'Italia la provincia di Bolzano è stata la prima ad intraprendere  un programma di eradicazione obbligatorio ed attualmente è già indenne. Piani di eradicazione sono in corso in diverse province e regioni italiane. Con decreto regionale 2710 del 17.06.08 anche la Regione Toscana ha varato un suo piano di eradicazione su base volontaria.
Il progetto di ricerca prevede di seguire l'andamento del piano di eradicazione regionale  in alcuni allevamenti della Toscana che hanno aderito al piano, con particolare riferimento ad allevamenti da riproduzione allevati allo stato brado.
In questi allevamenti particolare attenzione sarà prestata alla possibilità che il virus possa essere presente anche in popolazioni di ruminanti selvatici che condividono i pascoli con i bovini. In particolare durante la ricerca si prevede di monitorare sierologicamente caprioli e daini, in concomitanza con la caccia di selezione, in alcuni distretti di caccia della provincia di Grosseto.  Caso per caso sarà valutata l'efficacia del piano regionale ed evidenziati eventuali aspetti di criticità che rallentino l'eradicazione. Quando sarà necessario i controlli sierologici ufficiali saranno affiancati da prove diagnostiche supplementari eseguite nei nostri laboratori. I test utilizzati saranno gE ELISA, sieroneutralizzazione ed esame virologico su colture cellulari


Abstract 9


Several immunoenzymatic assays for serological diagnosis of HEV have been described and a great disparity in levels of sensitivity and specificity among the different tests has been recorded. The cost  of the ELISA kits commercially available is rather high and the use is limited to individual serological diagnosis in humans.
Recombinant ORF-2-derived antigens exhibited superior sensitivity and specificity and ORF-2 epitopes resulted broadly reactive across animal species and viral strains.  Identical seroconversion profiles were obtained with the truncated portion of the ORF-2 gene product from a strain of swine HEV and from a strain of human HEV demonstrating that the two antigens were interchangeable with respect to their ability to detect anti-HEV antibodies in human and swine. The source of viral RNA in this project will be an Italian swine strain genetically characterised. The viral ORF-2 will be amplified and cloned into a cloning vector. Then, the gene subunit  will be sub-cloned into pBlueBac baculovirus shuttle vector.  An his-tag will permit to purify the protein using resins. Antigenic characterization of the recombinant antigen will be evaluated by western blot using HEV ORF-2 specific monoclonal antibodies. Concentration of purified antigen will be determined with colorimetric assay and used to develop an indirect ELISA that could be patented for serological investigation both in humans and swine using the appropriate conjugate. Sensitivity and specificity of the test will be evaluated using well characterized animal and human sera obtained from different sources.

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Mercoledì, 27 Agosto 2014 10:19

ViroVet

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Members  Research in Progress  Recent Research
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VIROVET  is a group of researchers  which operate in the field of veterinary virology

inside the Department of Veterinary Science, University of Pisa, Italy.

 fig1

 

 

 

 

 

The activity is carried out in two laboratories of conventional virology and molecular virology and

include research in viral diseases of animals such as development and application of new

diagnostic tests, epidemiology, control,  eradication and  development of new vaccination strategies

fig2.jpg

 

 


 

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Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. E' necessario abilitare JavaScript per vederlo.">Prof. Francesco Tolari

Professor

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Associate Professor
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Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. E' necessario abilitare JavaScript per vederlo.">Dott. Maurizio Mazzei

Researcher

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Dott.ssa Maria Luisa Carrozza

Researcher

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Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. E' necessario abilitare JavaScript per vederlo.">Dott. Mario Forzan

Researcher

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Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. E' necessario abilitare JavaScript per vederlo.">Mrs. Giorgia Tozzini 

Laboratory technician

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Pubblicazioni

Dott.ssa Federica Pizzurro

Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. E' necessario abilitare JavaScript per vederlo.">PhD student

Curriculum Vitae

Pubblicazioni

Abdul 

Dott. Mahmoud Abdusalam Sharef

PhD student

Curriculum Vitae

Pubblicazioni

     

 

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1. Study of virulence determinants and development of DIVA strategy to control enzootic haemorrhagic disease of deer

Collaboration with Istituto Zooprofilattico dell'Abruzzo e del Molise, Teramo
Granted by Ministero della Salute

cervo

cellct


2. Nutraceutical effect of beta-glucans of bees infected with Deformed
Wing Virus (DWV)
Granted by funds of the University of Pisa

nutraceutica.jpg


3. Development of virus like particles for the epizootic haemorrhagic disease virus as a model for the generation of safe vaccines to control animal and human transmissible diseases.
Granted by Tuscan Region (type of grant: regional research in public health)

4. Technical support to the implementation of the health system in Bolivia: first pilot plan in the Chaco region
Granted by Regione Toscana

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5. Construction and validation of a mobile laboratory prototype with a BSL3 unit.
Collaboration with Istituto Zooprofilattico delle Venezie, Padova
Granted by: Fondazione Monte dei Paschi di Siena

 

 

Se non riesci a vedere il video segui questo link https://www.youtube.com/watch?v=Wy-YG_yu9u0 per accedere direttamente a YouTube.


6. Development of a recombinant antigen from an Italian swine isolate of hepatitis E virus to be used for the diagnosis of infections in humans and animals.
Granted by funds of the University of Pisa

Schermata_09-2457282_alle_16.30.13.png

 


 

Schermata

 

RECENT RESEARCH

Development of real time PCR protocols for the detection of viruses of honey bees
Granted with funds of the University of Pisa, 2011


 

Development of real-time and RT real-time PCR assays to evaluate the viral load in goats immunized with a small ruminant lentivirus strain
Granted by Italian Ministry of University, 2010


 

Development of virus like particles for the immunization of cattle against epizootic haemorrhagic disease virus
Granted by Italian Ministry of University (type of grant: rientro dei cervelli), 2009


 

Fortalecimiento de la red de salud en el Chaco Boliviano: una perspectiva comunitaria
Granted by Italian Ministry of Foreign Affairs, 2009


 

Development of PCR and ELISA for the diagnosis of Hepatitis E Virus infections in animals and phylogenetic studies on animal viral isolates
Granted by Italian Ministry of University, 2006


 

Development and application of techniques for the detection of cattle persistently infected by bovine diarrhoea virus
Granted by Italian Ministry of University, 2006


 

Evaluation of Lentivirus vaccination strategies in sheep
Granted by European Union, 2004


 

Evaluation of sea water pollution by means of detection of bacteriophages in Mytilus galloprovincialis
Granted by Italian Ministry of Environment, 2002


 

Development and evaluation of novel molecular diagnostic tests for the detection of Maedi Visna Virus infection
Granted by European Union, 1996

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