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Mercoledì, 23 Luglio 2014 10:20

Come Prelevare Tessuti

Alcuni consigli per consentire al laboratorio di utilizzare il materiale nelle migliori condizioni.

Evitare il congelamento dei tessuti! Il tessuto nervoso può mantenersi in condizioni ottimali per la "diagnostica di routine" fino a 24-36 ore, se mantenuto a +4°C. Modalità diagnostiche "speciali" e neuromuscolari richiedono specifici accorgimenti. Per qualsiasi problema, contattare il laboratorio.


Si prega di inviare il materiale patologico (tessuto nervoso, biopsie neuromuscolari, etc.) accompagnato da una esauriente scheda clinica [modulo di accompagnamento].

Diagnostica di routine (neuropatologia necroscopica o chirurgica)

Fissare i tessuti prelevati in formalina al 10% (biopsie operatorie, materiale prelevato dallo speco vertebrale, etc.).

Inviare l'encefalo intero previa completa fissazione in formalina al 10-20%. Nel caso di difficoltà operative, considerare l'invio del cadavere intero o della testa entro le 24 ore dalla morte con conservazione in ambiente refrigerato.
L'encefalo asportato deve essere riposto in un contenitore chiuso sufficientemente capiente da non provocare compressioni e/o distorsioni dell'organo e da contenere abbondante formalina. E' consigliabile porre del cotone nel fondo del recipiente [esempio].


Schema indicativo delle modalità e dei tempi minimi di fissazione dell'encefalo,
Animale
Durata   minima
di fissazione (gg)

Quantità minima

di formalina (ml)

Diametro minimo

del contenitore (cm)

 Gatto 2-3 250 8
Cane piccola  taglia 3 300 8
Cane media taglia 5 500 10
Cane grande taglia 7
500 10
 Piccolo ruminante 6-7
1000 15
 Suino  7 1000 15
 Bovino 15 5000 20
 Cavallo 15
5000 20

* Dopo 2-3 gg di fissazione, è preferibile sostituire la formalina con una soluzione fresca.Separare il cervello dal cervelletto e porre quest'ultimo in un altro contenitore

Sostituire la formalina dopo 24 ore di fissazione. Dopo il periodo minimo di fissazione, l'encefalo può essere spedito in un contenitore più piccolo, sempre in formalina.Per quanto riguarda il midollo spinale, inviare separatamente i segmenti midollari cervicale (C1-C5), cervico-toracico (C6-T2), toraco-lombare (T3-L3) e lombo-sacrale (L4-S3). Ridurre i diversi segmenti ad una lunghezza tale da non provocarne curvature all'interno del contenitore. Negli animali di grossa taglia, è consigliabile tagliare longitudinalmente la dura madre per permettere una migliore fissazione.


In caso di malattie neurodegenerative, dismetaboliche o multisistemiche, considerare l'invio anche di altri organi (fegato, rene, etc.).

In caso di sospetto di malattie da accumulo lisosomiale, è possibile effettuare una biopsia cutanea e richiedere un esame ultrastrutturale e/o dosaggi enzimatici su di fibroblasti. Per l'esame ultrastrutturale, fissare la biopsia in glutaraldeide al 2,5%; per i dosaggi enzimatici, richiedere al laboratorio il mezzo di trasporto per la biopsia.

Vista la complessità del trattamento del materiale, è preferibile comunque contattare il laboratorio.


Diagnostica neuromuscolare

E' sempre preferibile inviare biopsie di nervo e muscolo in caso di malattie neuromuscolari.

La biopsia del nervo deve essere della lunghezza di circa 2-3 cm e deve essere fissata in delicata tensione con due spilli ad entrambi i capi su un supporto rigido e rettilineo [esempio]. E' anche possibile utilizzare come supporto il bastoncino di un cotton-fioc al quale legare i fili di sutura utilizzati per separare i fascicoli nervosi durante l'intervento bioptico. Il nervo va immerso (con il supporto) in formalina al 10% in un contenitore chiuso.

La biopsia muscolare deve essere eseguita prelevando un cilindretto lungo circa 1,5 cm, largo e spesso 1 cm con l'accorgimento che le fibre siano orientate longitudinalmente alla lunghezza del cilindretto [esempio]. La biopsia deve essere inviata non fissata, avvolta in una garza imbevuta di soluzione fisiologica e riposta dentro una provetta da ematologia con tappo in gomma [esempio]. Inviare la biopsia muscolare (insieme alla biopsia di nervo) entro le 30 ore dal prelievo, se mantenuta refrigerata a +4°C. E' necessario che il campione così trattato venga mantenuto alla temperatura di refrigerazione anche durante il trasporto al laboratorio. A questo scopo è opportuno utilizzare delle mattonelle refrigerate e proteggere le provette dagli urti da trasporto. Esistono in commercio contenitori di provette refrigerabili che ne garantiscono anche un'adeguata protezione [esempio].
E' preferibile inviare anche un secondo campione di muscolo delle stesse dimensioni fissato in formalina al 10%.

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Mercoledì, 23 Luglio 2014 10:06

Asportazione del Sistema Nervoso Centrale

Apertura della scatola cranica e rimozione dell'encefalo

1) RIMOZIONE DELLA TESTA 

  • individuare l’articolazione occipito-atloidea (il punto di repere è rappresentato dalle ali dell’atlante);
  • recidere le masse muscolari e i legamenti intervertebrali a questo livello;
  • disarticolare l’atlante dall’osso occipitale separando la testa dal resto del corpo;


2) APERTURA DELLA SCATOLA CRANICA 

a. incidere la cute sulla linea sagittale mediana dal setto nasale al foramen magnum;

b. scollare i lembi cutanei e ribaltarli ventralmente; 
c. tagliare i condotti uditivi; 
d. rimuovere i muscoli temporali; 

e. incidere la scatola cranica con tre incisioni effettuate tramite sega a lama vibrante (sega di Stryker):
la prima incisione deve avere un orientamento trasversale e deve essere condotta circa 2 cm caudalmente alle arcate sopraciliari; le altre sono simmetriche su ambedue i lati della scatola cranica e partono dal margine laterale della prima incisura e arrivano fino all’osso occipitale (interessando quindi osso frontale e temporale) che deve essere inciso dorsalmente ai condili occipitali. ATTENZIONE: mentre la prima incisione a livello dei seni frontali e l’incisione a livello della cresta nucale possono essere effettuate con forza dato il notevole spessore delle strutture ossee, le incisioni laterali devono essere effettuate con la massima delicatezza in quanto le ossa sono sottili ed è facile coinvolgere il sottostante encefalo!! 
f. tramite l’utilizzo di uno scalpello infisso nella prima incisione trasversale sollevare la calotta cranica e asportare quest’ultima interamente recidendo i punti di contatto della dura madre. Esaminare attentamente la superficie interna della calotta cranica.

3) RIMOZIONE DELL’ENCEFALO 

  • capovolgere la testa e liberare l’encefalo partendo dal foro occipitale resecando le meningi, l'emergenza dei nervi cranici, le arterie cerebrali medie e il peduncolo ipofisario. Liberare i peduncoli olfattori dalla lamina cribrosa dell'etmoide tramite una delicata trazione sull'encefalo;
  • esaminare attentamente l’encefalo e il neurocranio, senza praticare incisioni ed effettuare eccessive manipolazioni;
  • seguire le indicazioni per la corretta fissazione del tessuto nervoso.
 

1) APERTURA DELLO SPECO VERTEBRALE E RIMOZIONE DEL MIDOLLO SPINALE    
 

a. Con il cadavere in posizione ventro-dorsale, incidere la cute lungo la linea sagittale mediana per tutta la lunghezza della colonna vertebrale; 

 


b. Scollare e ribaltare la cute e il sottocute; 

c. Asportare i muscoli paravertebrali, fino alla liberazione della porzione dorsale delle vertebre; 

d. Gli archi vertebrali toracici devono essere rimossi per primi in modo da visualizzare il corretto posizionamento della sega nel canale vertebrale al fine di evitare traumatismi al midollo. Vertebre toraciche: asportare i processi spinosi con un taglio alla loro base mediante sega di Stryker; incidere gli archi vertebrali in corrispondenza dei processi mammillari con un'inclinazione di circa 45° (vedi schema a lato); rimuovere la volta vertebrale mediante pinze robuste incidendo trasversalmente anteriormente a T1 e caudalmente a T13; 

e. Vertebre lombari: mediante sega di Stryker incidere gli archi vertebrali subito dorsalmente ai processi trasversi e perpendicolarmente ai processi spinosi; incidere trasversalmente a livello della giunzione lombosacrale e rimuovere la volta vertebrale; 

f. Vertebre cervicali: mediante sega di Stryker incidere gli archi vertebrali a livello di una linea posta a metà tra processo spinoso e processo trasverso con un orientamento parallelo ai processi spinosi; rimuovere la volta vertebrale ed esporre il midollo spinale; 

g. Vertebre sacrali: generalmente l’apertura del sacro non è necessaria; comunque se si sospettano lesioni a livello della cauda equina, è necessario incidere mediante sega di Stryker tra cresta sacrale laterale e intermedia per esporre il canale sacrale vertebrale.

 

 2) RIMOZIONE DEL MIDOLLO SPINALE 

  • rimuovere il midollo spinale afferrandolo per la dura madre e resecando l'emergenza dei nervi evitando di piegare o torcere il midollo stesso;
  • ispezionare accuratamente il midollo spinale e il canale midollare per tutta la sua lunghezza per valutare la presenza di eventuali ernie discali, masse osteofitiche o neoplastiche;
  • seguire le indicazioni per la corretta fissazione del tessuto nervoso.